摘要

凝膠滲透色譜（GPC）與多角度靜態光散射（SLS）相結合，是一種先進且強大的用技術，能夠無需依賴傳統的柱校準即可得到絕對分子量值。GPC-SLS 技術通過定量評估信號強度而不是通過洗脫時間來得到分子量。此外，與聚合物標準校準不同，要準確解讀光散射信號，需要知道樣品的準確濃度、進樣體積及相應質量等信息。

引言

凝膠滲透色譜（GPC）是一種用于測定蛋白質、聚合物和許多其他納米材料分子量的有用技術。然而，其應用受到必須使用已知分子量（M_w）標準樣品對 GPC 柱進行校準的限制，這些標準樣品的化學性質可能與未知樣品不同。色譜柱的分離機制基于流體動力學和尺寸排阻。在使用不同的洗脫液時，某些樣品在洗脫過程中可能會粘附在固定相上，從而導致分子量測量結果不準確。更好的方法是給 GPC 系統配備多角度光散射（MALS）檢測器，從而無需柱校準即可準確測量分子量。先通過 GPC 對樣品進行分離，然后由而 MALS 檢測器測量絕對分子量M_w。

布魯克海文儀器公司的分子量分析儀（BI-MwA）是一種多角度靜態光散射（MALS）檢測器，通常與BI-DNDC（示差檢測器）一起與 GPC 系統配套使用。通過光纖與內部流動池耦合，可在 7 個固定角度下采集信號，從而實現散射光的角度依賴性測量。使用這種檢測器配置進行的典型 GPC 實驗會生成包含多達三條曲線的色譜圖：紫外（UV）、示差（RI）和光散射（LS）。紫外檢測器通常不適合用于檢測合成聚合物，因為與蛋白質樣品不同，合成聚合物往往只有極小的紫外吸收或無紫外吸收。光散射曲線可以展開，分別顯示每個角度的散射光強度。

基礎的 GPC 系統由單根色譜柱、進樣器、泵和檢測器組成，高端 HPLC 系統則可能配備多個檢測器、自動進樣器、色譜柱恒溫箱等更多組件。無論那種情況，GPC 色譜柱本身和檢測器都是最重要的組件。布魯克海文公司的 MwA 能夠獲取現有 GPC 系統中各類檢測器的模擬輸出，從而提供額外的檢測功能，如粘度、紫外和示差。這些數據可以讀入布魯克海文儀器公司的尺寸排阻色譜采集軟件 ParSEC 中，以生成統一的色譜圖。通過整合這些數據，既能計算出色譜圖中任意一點的瞬時分子量，也能算出預選范圍內的平均分子量。

實驗設置

分析

對所得數據有三種分析方式，可根據樣品的已知信息進行選擇。對于未知樣品，可能有兩個已知參數：進樣量和樣品的 dn/dc 值。

以下列出三種可能的情況：

結果

我們已經證明了準確測定色譜柱中注入樣品濃度的重要性。如下表所示，即使進樣體積存在微小差異，表觀分子量（M_w）也會發生顯著變化。

使用正確進樣體積與使用錯誤設置體積計算的對比

上表示例展示了進樣體積變化的影響。數據由布魯克海文儀器公司的 ParSEC 軟件采集，并以三種方式進行分析。分析在已知濃度但未知 dn/dc 值的情況下進行。從分析結果來看，得到的分子量也變化了約 1%，這說明了進樣體積變化的影響。

在典型操作中，ParSEC 軟件根據 Zimm 方程生成 Zimm 圖，并將光散射數據外推至零角度，進而計算出絕對濃度和分子量。由于只有單個濃度的數據，因此無法外推至零濃度。但是，與所有 GPC/SEC 軟件一樣，ParSEC 軟件允許對第二維里系數進行校正。

結論

布魯克海文公司的 MwA 是一款功能強大的儀器，可以顯著提升現有 GPC 系統的性能。可重復的進樣量對多角度靜態光散射（MALS）與 GPC、SEC 或其他色譜聯用技術至關重要。由于濃度是 Zimm 方程（見附錄）中的一個關鍵變量，而 Zimm 方程又是計算分子量的基礎，因此這一點十分必要。

• 分析方法的選擇。如果進樣器的重復性不優于 2%，最好選擇已知 dn/dc 值但未知進樣量（濃度和進樣體積）的分析方法。
• 進樣器性能指標。在分析 dn/dc 值未知的樣品時（這是最常見的情況），進樣器的重復性應優于 1%。這一指標很容易達到。
• 樣品濃度性能指標。在分析 dn/dc 值未知的樣品時（這是最常見的情況），樣品濃度的準確度應優于 1%。這一指標也很容易達到。

附錄

光散射計算

在計算分子量時，通常使用 Zimm 方程來分析光散射數據：

Kc/ΔR = 1/M_w (1 + (q² R_g² )/3) + 2 A₂ c

其中，K為德拜常數，是聚合物-溶劑或蛋白質-溶劑體系的一個常數。對于垂直偏振的光，

K = 4 π²n²(dn/dc)²/(N_aλ⁴)

其中n為溶劑折光率，N_a為阿伏伽德羅常數，λ為激光波長。c 為聚合物濃度，在制備樣品溶液時精確確定，ΔR 表示溶液的散射光強與純溶劑散射光強的差值，可通過實驗測量。